Конфокальная микроскопия - один из современных методов исследования; позволяет проводить прижизненный мониторинг состояния роговицы с визуализацией тканей на клеточном и микроструктурном уровне.

Данный метод в силу оригинальной конструкции микроскопа и его большой разрешающей способности позволяет визуализировать живые ткани роговицы, измерить толщину каждого из её слоён, а также оценить степень морфологических нарушений.

Охарактеризовать морфологические изменения роговицы, возникающие при различных воспалительных и дистрофических её заболеваниях, а также вследствие хирургических вмешательств и воздействия КЛ.

Данные морфологического исследования необходимы, чтобы оценить тяжесть патологического процесса, эффективность лечения и определить тактику ведения больного.

Показания

Воспалительные заболевания роговицы (кератиты).
Дистрофические заболевания роговицы (кератоконус, дистрофия Фукса и др.).
Синдром «сухого глаза».
Состояния после хирургических вмешательств на роговице(сквозной пересадки роговицы, кераторефракционных операций).
Состояния, связанные с ношением КЛ.

Противопоказания

Относительное противопоказание выраженное раздражение глаза на фоне острого воспалительного процесса.

Подготовка


Проведение данного исследования возможно без применения анестетиков. На объектив линзы конфокального микроскопа помещают каплю иммерсионной жидкости. Это исключает непосредственный контакт линзы с роговицей и сводит к минимуму риск повреждения эпителия.

Методика

Исследование выполняют на конфокальном микроскопе ConfoScan 4 (Nider) с увеличением в 500 раз. Прибор позволяет осмотреть роговицу по всей её толщине.

Размер исследуемой зоны составляет 440x330 мкм, толщина слоя сканирования - 5 мкм. Линзу с каплей геля подводят к роговице до касания и устанавливают так. чтобы толщина слоя иммерсионной жидкости составляла 2 мм. Конструкция прибора позволяет исследовать роговицу в центральной зоне и её парацентральных участках (рис. 7-1; рис. 7-2.).


Интерпретация

Нормальная морфологическая картина роговицы

Передний эпителий состоит из 5-6 слоев клеток. Средняя толщина всего эпителия - приблизительно 50 мкм. По морфологической структуре выделяют следующие слои (изнутри кнаружи): банальный, шиловидных клеток и поверхностный.

Самый внутренний (базальный) слой представлен маленькими плотными цилиндрическими клетками без видимого ядра. Границы базальных клеток чёткие, яркие (рис. 7-3).

Средний слой состоит из 2-3 пластов шиповидных (крылатых) клеток с глубокими инвагинациями, в которые встраиваются выросты соседних клеток. Микроскопически границы клеток довольно хорошо различимы, а ядра могут не определяться или быть нечёткими (рис. 7-4).

Поверхностный слой эпителия представлен одним или двумя пластами полигональных клеток с чёткими границами и гомогенной плотностью. Ядра обычно ярче, чем цитоплазма, в которой также можно различить околоядерное тёмное кольцо (рис. 7-5).

Среди клеток поверхностного слоя различают тёмные и светлые. Повышенная отражательная способность эпителиальных клеток свидетельствует о снижении в них уровня метаболизма и начинающейся их десквамации.

Боуменова мембрана прозрачная структура, не отражающая свет, поэтому в норме при конфокальной микроскопии её визуализация невозможна.

Суббазальное нервное сплетение находится под боуменовой мембраной. В норме нервные волокна выглядят как параллельно идущие на тёмном фоне яркие полосы, контактирующие между собой. Рефлективность (отражательная способность) может быть неравномерной по протяжению волокна (рис. 7-6).

Строма роговицы занимает от 80 до 90% толщины роговицы и состоит из клеточного и внеклеточного компонента. Основные клеточные элементы стромы- кератоциты; составляют примерно 5% объёма.

Типичная микроскопическая картина стромы включает несколько ярких неправильной овальной формы тел (ядер кератоцитов), которые лежат в толще прозрачного тёмно-серого или чёрного матрикса. В норме визуализация внеклеточных структур невозможна из-за их прозрачности. Строма может быть условно разделена на субслои: передний (расположен непосредственно под боуменовой мембраной и составляет 10% толщины стромы), переднесредний, средний и задний.

Средняя плотность кератоцитов выше в передней строме, постепенно их количество уменьшается по направлению к задним слоям. Плотность клеток передней стромы почти в два раза больше, чем клеток задней стромы (если плотность клеток передней стромы принять за 100%, то плотность клеток задней составит около 53,7%). В передней строме ядра кератоцитов имеют округлую бобовидную форму, а в задней овальную и более вытянутую (рис. 7-7.7-8).


Ядра кератоцитов могут различаться по яркости. Различная способность отражать свет зависит от их метаболического состояния. Более яркие клетки принято считать активированными кератоцитами («стрессовыми» клетками), деятельность которых направлена на поддержание внутреннего гомеостаза роговицы. В норме и поле зрения встречаются единичные активированные клетки (рис. 7-9).

Нервные волокна в передней строме роговицы визуализируются в виде ярких гомогенных полос, нередко образующих бифуркации (рис. 7-10).

Десцеметова мембрана в норме прозрачна и не визуализируется при конфокальной микроскопии.

Задний эпителий представляет собой монослой гексагональных или полигональных плоских клеток с равномерно светлой поверхностью на фоне чётких тёмных межклеточных границ (рис. 7-11).

В приборе заложена возможность мануального или автоматического подсчёта плотности клеток, их площади и коэффициента вариабельности.

Патологические изменения строения роговицы

Кератоконус характеризуется значительными изменениями в переднем эпителии и строме роговицы.

Передний эпителий. Обнаруживают различные варианты эпителиопатии (рис. 7-12).

Конфокальная микроскопия — один из методов оптической микроскопии, обладающий значительным контрастом по сравнению с микроскопами классической схемы за счет использования диафрагмы, отсекающей поток фонового рассеяного света. В конфокальном микроскопе в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того, чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой, проходит через диафрагму и будет зарегистрирован, а свет от остальных точек в основном задерживается диафрагмой.

Повышение контраста изображения также достигается за счет того, что осветитель создает не равномерную освещенность поля зрения, а фокусирует свет в анализируемую точку. Это может достигаться расположением второй фокусирующей системы за образцом, но при этом требуется, чтобы образец был прозрачным. Кроме того, объективные линзы обычно сравнительно дорогие, поэтому использование второй фокусирующей системы для подсветки мало предпочтительно. Альтернативой является использование светоделительной пластинки, так чтобы и падающий и отраженный свет фокусировались одним объективом. Такая схема к тому же облегчает юстировку.

Уменьшение отверстия в диафрагме приводит к уменьшению толщины оптического слоя, что повышает контрастность изображения, однако при этом падает его яркость, что требует использования высокочувствительных регистрирующих систем и в процессе исследования заставляет идти на компромисс между яркостью и контрастом получаемого изображения.

Наиболее часто встречающейся задачей для конфокальной микроскопии, благодаря ее высокому разрешению и контрасту, является изучение структуры клеток и их органелл, например, цитоскелета, ЭПР, лизосом, митохондрий, ядра, хромосом и даже генов. Исследуется также колокализация в клетке двух и более веществ. Еще одна задача - исследование динамических процессов, происходящих в живых клетках. Например, клеточного транспорта биологически-активных соединений, изменений концентрации и распределения ионов кальция. Записав в памяти компьютера серию оптических срезов, можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов.

Новыми перспективными направлениями являются методики FRAP - Fluorescence Recovery After Photobleaching (Восстановление флуоресценции после фотовыжигания) и FRET - Fluorescence Resonance Energy Transfer (Передача энергии посредством флуоресцентного резонанса).

Глоссарий:

FRAP применяется для исследования подвижности биоорганических молекул посредством инициации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения и последующего его рассоединения с молекулами. После выжигания молекулы с флуорохромом из необлученной зоны движутся вследствие диффузии в облученную зону образца. По времени нарастания в ней флуоресценции можно судить о подвижности молекул.

FRET применяется для определения расстояния между молекулами разных типов, их окружения и взаимодействия. Молекулы метятся двумя флуорохромами со спектром испускания донора, перекрывающимся со спектром поглощения акцептора. Энергия от донора к акцептору передается на малых расстояниях (несколько нм) в результате резонанса между энергетическими уровнями, а его вероятность зависит от расстояния между молекулами. Затем акцептор излучает энергию в видимой области спектра, которая регистрируется конфокальным микроскопом.

Двухфотонная (мультифотонная) микроскопия - Two Photon (Multiphoton) Microscopy - Методика, производная от лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, при которой возбуждение флуорохромов осуществляется лазерным излучением инфракрасного или длинноволнового видимого диапазона, плотность которого удваивается или даже утраивается в месте фокусировки на образце. Флуорофоры образца переводятся в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами, что эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном. Например, возбуждение двумя или тремя фотонами с длиной волны 900 нм эквивалентно возбуждению одним фотоном с длиной волны 450 или 300 нм. Мультифотонная микроскопия обеспечивает более глубокое проникновение в толщу тканей и не требует наличия конфокальной микродиафрагмы, так как ее флуоресценция возникает строго в фокальной плоскости.

Акусто-оптический перестраиваемый фильтр (AOTF) - Acousto- Optic Tunable Filter (AOTF) - Фильтрующее устройство, использующее звуковые колебания для модулирования длины волны или интенсивности света, испускаемого лазером или некогерентным источником света (в первую очередь дуговыми лампами). Фильтр состоит из специализированного кристалла (оксид теллура или кварц), зажатого с двух сторон акустическими излучателем и поглотителем для наведения в кристалле стоячих акустических волн с переменными зонами высокого и низкого преломления. Если поляризованный или неполяризованный свет проходит через фильтр, кристалл воздействует на него как дифракционная решетка, отклоняющая проходящий луч. Для изменения периода дифракционной решетки выбираются характерные длины стоячих волн, получаемые в результате изменения звуковых колебаний, подводимых к кристаллу.

Полосовой фильтр - Bandpass Filter - фильтр, пропускающий определенный диапазон (полосу) длин волн ослабляя при этом волны большей и меньшей длины, чем у пропускаемых. Длина волны в середине пропускаемой полосы обычно называется средней (английская аббревиатура CWL). Эффективная полоса пропускания измеряется шириной зоны, пропускающей половину от максимума падающего света, которая еще называется полосой половинного пропускания (аббревиатуры FWHM и HBW). В флуоресцентной микроскопии полосовые фильтры чаще используются в тракте возбуждения и реже в качестве пороговых (барьерных) фильтров.

Светоделитель - Beamsplitter - Оптическое устройство, используемое для разделения падающего светового луча на две или более составляющих, каждые из которых проецируются в различных направлениях. Для выполнения каких-либо определенных условий светоделители бывают различных конфигураций. В окулярных блоках оптических микроскопов используются призматические светоделители для одновременного проецирования изображения в окуляры и фотокамеру (цифровую камеру). Для получения линейно поляризованного света применяются поляризующие светоделители из природного кварца - материала с двойным преломлением. В флуоресцентной микроскопии для отражение волн возбуждения обратно к источнику и пропускания более длинноволнового вторичного флуоресцентного излучения к окулярам и детектору в качестве светоделителей используются дихроматичные (дихроичные) зеркала.

Холодное зеркало - Cold Mirror - Специализированный дихроматичный интерференционный фильтр, который в очень широком диапазоне температур отражает весь видимый спектр, но очень эффективно пропускает волны в инфракрасной области. Аналогично горячим зеркалам холодные могут быть разработаны для отражения лучей, падающих под углами от нуля до 45 градусов и представлять собой многослойные диэлектрические покрытия наподобие интерференционных фильтров. Холодные зеркала могут использоваться в качестве дихроматических светоделителей в лазерных системах для отражения видимого света и пропускания инфракрасного.

Дихроматичный светоделитель (дихроичное зеркало) - Dichromatic Beamsplitter (Dichroic Mirror) - Комбинация интерференционных фильтров/зеркал обычно применяемая в наборах фильтров для флуоресцентной микроскопии для получения четко определяемого перехода между пропускаемыми и отраженными длинами волн. Дихроматичное зеркало, наклоненное под углом 45 градусов к падающему свету и испускаемому излучению, отражает коротковолновое излучение возбуждения под углом 90 градусов на образец и пропускает более длинноволновое излучение от образца на окуляры и детектор. Дихроматичные зеркала для флуоресцентной микроскопии, изготовленные с использованием тонких интерференционных пленок способны отразить до 90 % возбуждающего излучения, одновременно пропуская до 90 % полосы флуоресцентного излучения. Дихроматичные зеркала обычно являются центральным (основным) элементом в трех видах фильтров (возбуждения, барьерных и дихроматичных зеркал), находящихся в составе блока флуоресцентных оптических фильтров.

Скат фильтра - Filter Slope - Скат оптического фильтра - это характеристика профиля фильтра в области перехода от запирания к пропусканию. В целом, скат фильтра характеризуется длиной волны, на которой фильтр демонстрирует определенный коэффициент пропускания и крутизну характеристики в этом месте. Два различных фильтра могут иметь одни и те же частоты среза, но совершенно разные уровни запирания и скаты. Фильтры с очень крутыми скатами имеют узкую полосу пропускания, в то время как пологие скаты означают широкую полосу.

Полная ширина на половине максимума - Full Width at Half Maximum (FWHM) - Диапазон длин волн пропускаемых стеклянным или интерференционным фильтром описывается параметром, известным как полная ширина на половине максимума (FWHM). Границы среза определяются как наименьшая и наибольшая длины волн, пропускаемые фильтром на уровне 50% от максимума, а средняя длина волны (CWL или СДВ) представляет собой среднее арифметическое от всех длин волн внутри диапазона. Например, величина FWHM, равная 40 означает, что ширина пропускаемого диапазона волн составляет 40 нм, причем значение СДВ (CWL) может лежать где угодно от ультрафиолетовой до инфракрасной частей спектра. Во многих текстах FWHM может обозначаться как половинная полоса пропускания (half bandwidth, HBW).

Видеокамеры ISIT - Intensifier Silicon- Intensifier Target (ISIT) Camera - Видеокамеры, предназначенные для работы при низком уровне освещения, как например в флуоресцентной микроскопии образцов с очень низким квантовым выходом. Эти камеры как правило включают в себя SIT - трубку (с диодной матрицей) дополненную усилителем изображения в комбинации с волоконной оптикой на первой ступени усиления света.

Ближнепольная сканирующая оптическая микроскопия (БСОМ ) - Near- Field Scanning Optical Microscopy (NSOM) - Ближнепольное изображение получается при размещении оптического зонда (световода) субмикронного размера на чрезвычайно близком расстоянии от изучаемого объекта, а свет пропускается через небольшую диафрагму на конце зонда. Под ближним полем понимается зона над поверхностью изучаемого объекта размером меньше длины волны падающего света. В пределах ближнего поля затухающий свет не ограничен дифракцией, и возможно получение информации относительно объектов нанометрового порядка. Это явление позволяет получать изображения за пределами дифракционного барьера и проводить спектроскопию образцов, недостижимую средствами обычной оптической микроскопии.

Развитие генной инженерии, протеомики, биотехнологии, современной фармацевтики и биомедицины способствовало быстрому внедрению новых методов конфокальной микроскопии, и в настоящее время они широко используются в клеточной биологии.

Конфокальную флуоресцентную микроскопию можно рассматривать как разновидность традиционной флуоресцентной микроскопии, которая позволяет исследовать внутреннюю микроструктуру клеток, причем не только фиксированных, но и живых, идентифицировать микроорганизмы, структуры клетки и отдельные молекулы, наблюдать динамические процессы в клетках. Конфокальная флуоресцентная микроскопия в дополнение к этому обеспечила возможность трехмерного субмикронного разрешения объекта и существенно расширила возможность неразрушающего анализа прозрачных образцов. Повышение разрешающей способности достигается благодаря использованию в конфокальных микроскопах лазеров в качестве источников света и конфокальной диафрагмы для фильтрации внефокусной флуоресценции. Преимущество лазеров по сравнению с ртутными или ксеноновыми лампами заключается в монохроматичности и высокой параллельности испускаемого пучка света. Эти свойства лазерного излучения обеспечивают более эффективную работу оптической системы микроскопа, уменьшают число бликов, улучшают точность фокусировки пучка света. На образце лазер освещает не все поле зрения, как в ламповом флуоресцентном микроскопе, а фокусируется в точку. Конечно, при этом лазерный луч возбуждает флуоресценцию как в точке фокуса, так и во всех слоях образца, через которые проходит. И если эта внефокусная флуоресценция, излучаемая слоями, расположенными выше и ниже фокальной плоскости, регистрируется вместе с основным сигналом из фокуса объектива, это ухудшает разрешение оптической системы. Избавиться от внефокусной флуоресценции позволяет конфокальная диафрагма. Изменяя диаметр конфокальной диафрагмы, можно определять толщину оптического слоя вблизи фокуса лазерного луча, поэтому флуоресценция, испускаемая выше и ниже фокуса, оказывается дефокусированной на конфокальной диафрагме и не регистрируется. Благодаря этому конфокальная микроскопия обеспечивает улучшенное разрешение, в первую очередь вдоль оси Z.

Современная конфокальная микроскопия позволяет решать три основные задачи: изучение тонкой структуры клетки, колоколизации (пространственного взаиморасположения) в клетке двух или более веществ, а так же исследование динамических процессов, протекающих в живых клетках.

Благодаря улучшенному разрешению, особенно повышенному разрешению по оси Z, и возможности создавать серии «оптических» срезов, конфокальный микроскоп позволяет исследовать тонкую структуру объекта в трехмерном пространстве. Специальные программы позволяют создать из серии оптических срезов объемное изображение объекта (3D) и как бы рассматривать его под разными углами зрения, что может дать ценную информацию о форме клеток, цитоскелете, структуре ядра, хромосомах и даже локализации в них отдельных генов, а так же о взаиморасположении этих элементов.

Использование мультиспектрального (с несколькими флуорохромами) режима работы лазерного сканирующего конфокального микроскопа позволяет исследовать колоколизацию (пространственное взаиморасположение) в клетке двух или более разных веществ, например, белков, помеченных разными флуоресцентными красителями. Исследуя такие препараты в обычном флуоресцентном микроскопе, нельзя с уверенностью утверждать, находятся эти вещества рядом или одно под другим. С помощью метода оптических срезов и дальнейшей 3D-реконструкции объекта можно воссоздать объемное распределение веществ. Мультиспектральный режим так же позволяет проводить на конфокальном микроскопе исследования методом FISH.

Методы конфокальной микроскопии позволяют выявить способность веществ накапливаться в цитоплазме, ядре или других структурах клетки, зарегистрировать образование метаболитов, измерить кинетику накопления и метаболизма веществ в клетке, скорость выведения веществ из клетки, сравнить интенсивность метаболизма в различных клеточных линиях и в различных условиях. Эти методы все шире применяются в исследованиях механизмов действия как канцерогенов, так и лекарственных препаратов и противоопухолевых соединений, позволяют рассчитывать их эффективные концентрации.

Анализ интенсивности и формы спектров собственной флуоресценции позволяет распознавать нормальные и воспаленные клетки, и такой метод, в частности, предложен в качестве нового способа ранней диагностики шейки матки.

Подобрав комбинацию фильтров для нескольких типов собственной флуоресценции, возможно без проведения гистохимического окрашивания и трудоемкого получения и исследования множества срезов различать злокачественные и нормальные тканевые структуры в биопсийных пробах лимфоузлов пациентов с лимфоаденопатией различного происхождения.

Методы конфокальной микроскопии широко применяются в эмбриологии и гидробиологии, ботанике, зоологии при изучении структуры гамет, развития и формирования организмов.

История

В 50-х годах биологам понадобилось увеличить контраст наблюдения меченых флюорохромами объектов в толстых срезах тканей . Для разрешения этой проблемы Марвин Минский , профессор в США, предложил использовать для флуоресцентных микроскопов конфокальную схему. В 1961 г. Минский получил на эту схему патент .

Принцип работы

Конфокальный микроскоп имеет разрешение такое же как и обычный микроскоп и ограничено оно дифракционным пределом .

где длина волны излучения, - числовая апертура объектива, - показатель преломления среды между образцом и объективом, - половина угла, который «захватывает» объектив. В видимом диапазоне разрешение составляет ~ 250 нм (NA=1,45, n=1,51) Однако, в последние годы успешно развиваются схемы микроскопов, которые используют нелинейные свойства флуоресценции образцов. В этом случае достигается разрешение значительно меньшее дифракционного предела и составляет ~ 3-10 нм .

Конфокальный микроскоп создаёт чёткое изображение образца, которое при использовании обычного микроскопа представляется размытым. Это достигается путем отрезания апертурой фонового света идущего из глубины образца, то есть того света, который не попадает на фокальную плоскость объектива микроскопа. В результате изображение получается с контрастом лучшим, чем в обычном оптическом микроскопе.

Изображение представляет собой двумерную (2D) картину.

См. также

Преимущества в биологии перед другими микроскопами

Показатель преломления биологических объектов почти такой же как у стекла, поэтому наблюдение этих объектов, находящийся на поверхности предметного стекла, в обычном микроскопе весьма затруднено. Конфокальный микроскоп, имеющий высокий контраст, даёт две неоценимые возможности: он позволяет исследовать ткани на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности, а также оценивать результаты исследования (то есть клеточной активности) в четырёх измерениях - высота, ширина, глубина и время.

Примечания

Ссылки

  • Molecular Expressions : Laser Scanning Confocal Microscopy
  • Nikon’s MicroscopyU . Comprehensive introduction to confocal microscopy.
  • Emory’s Physics Department . Introduction to confocal microscopy and fluorescence.
  • The Science Creative Quarterly’s overview of confocal microscopy - high res images also available.
  • Programmable Array Microscope - Confocal Microscope Capabilities.

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Конфокальный микроскоп" в других словарях:

    У этого термина существуют и другие значения, см. Микроскоп (значения). Микроскоп, 1876 год … Википедия

    Атомно силовой микроскоп Атомно силовой микроскоп (АСМ, англ. AFM atomic force microscope) сканирующий зондовый микроскоп высокого разрешения. Используется для определения рельефа поверхности с разрешением от дес … Википедия

    Общее название методов наблюдения в микроскоп неразличимых человеческим глазом объектов. Подробнее см. в ст. (см. МИКРОСКОП). Физический энциклопедический словарь. М.: Советская энциклопедия. Главный редактор А. М. Прохоров. 1983 … Физическая энциклопедия

    - (англ. nitrogen vacancy center) или азото замещённая вакансия в алмазе это один из многочисленных точечных дефектов алмаза. Дефект представляет собой нарушение строения кристаллической решётки алмаза, возникающий при удалении атома… … Википедия

    В Википедии есть статьи о других людях с такой фамилией, см. Мински. В Википедии есть статьи о других людях с такой фамилией, см. Минский. Марвин Ли Мински англ. Marvin Lee Minsky … Википедия

    Мински, Марвин Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия

    Мински, Марвин Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия

    Мински, Марвин Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия

    Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия

Книги

  • Конфокальная микроскопия и ультрамикроскопия живой клетки , Свищев Георгий Михайлович. Конфокальный микроскоп - это разновидность сканирующего светового микроскопа. При исследовании толстых объектов он дает изображения, свободные от фона, которые вобычных микроскопах создается…

Люминесцентная, или флюоресцентная, микроскопия - метод гистологического анализа с помощью люминесцентного микроскопа, в котором используется явление люминесценции (свечения) веществ при действии на них коротковолновых лучей (ультрафиолетового света, рентгеновских лучей). Некоторые биологические соединения, присутствующие в клетках, характеризуются спонтанной флюоресценцией при попадании на клетку ультрафиолетовых лучей. Для выявления же большинства других соединений клетки обрабатываются специальными флюорохромами (флюо-ресцеином, акридином оранжевым, корифосфином). С помощью флюорохромов исследуют, например, содержание в клетках нуклеиновых кислот. При окраске акридином ДНК дает красно-зеленое свечение, а РНК - оранжевое.

Люминесцентный микроскоп широко используется также для изучения иммунофлюоресценции. Иммунофлюоресценция позволяет исследовать в клетке содержание очень малых количеств белка. Препарат предварительно обрабатывают антителами к исследуемому белку, меченными флюоресцирующим красителем.

Ультрафиолетовая микроскопия - метод изучения клеток с помощью микроскопов, в которых для освещения объекта используют ультрафиолетовые лучи (длина волны которых равна 210-275 нм). Такие микроскопы имеют большую, чем обычные световые микроскопы, разрешающую способность. Для наблюдения за объектом требуется специальная аппаратура - электронно-оптический преобразователь, который предохраняет орган зрения от действия ультрафиолетовых лучей.

Электронная микроскопия . В электронных микроскопах используют пучок электронов, длина электромагнитной волны которых в 100 000 раз короче длины волны видимого света. Разрешающая способность электронного микроскопа в сотни и тысячи раз превышает обычные оптические приборы и равна 0,5-1 нм, а современные мегавольтные электронные микроскопы дают увеличение до 1 000 000 раз. С помощью электронных микроскопов получены многочисленные данные об ультраструктуре клеток. Разновидностью электронной микроскопии является сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), при которой изучаются поверхностные структуры клеток.

Цитоспектрофотометрия - метод изучения химического состава клетки, основанный на избирательном поглощении теми или иными веществами лучей с определенной длиной волны. По интенсивности поглощения света, которая зависит от концентрации вещества, производится количественное определения его содержания в клетке.

Радиоавтография - важный информативный метод, позволяющий изучать распределение в клетках и тканях веществ, в состав которых искусственно введены радиоактивные изотопы (3Н, НС, 32Р и др.). Введенный в организм животного (или в среду культивирования клеток) изотоп включается в соответствующие структуры (например, меченый тимидин - в ядра клеток, синтезирующих ДНК). Метод основан на способности включенных в клетки изотопов восстанавливать бромистое серебро фотоэмульсии, которой покрывают срезы ткани или клетки. Образующиеся после проявления фотоэмульсии зерна серебра (треки) служат своего рода автографами, по локализации которых судят о включении в клетку примененных веществ. Применение меченных тритием предшественников нуклеиновых кислот (тимидина, аденина, цитидина, уридина) позволило выяснить многие важные аспекты синтеза ДНК, РНК и клеточных белков.

Гисто- и иммуноцитохимические методы . В их основе лежит применение химических реакций для выявления распределения химических веществ в структурах клеток, тканей и органов. Современные гистохимические методы позволяют обнаруживать аминокислоты, белки, нуклеиновые кислоты, различные виды углеводов, липидов и др. Для выявления специфических белков используют иммуноцитохимические реакции. Для этого получают специфические сыворотки, содержащие антитела (например, против белка микротрубочек - тубулина). Далее химическим путем соединяют эти антитела с флюорохромом (или другим маркером). Если меченые антитела нанести на гистологический срез, они вступают в соединение с соответствующими белками клетки и возникает специфическое свечение, видимое в люминесцентном микроскопе. Современные иммуноцитохимические методы, помимо флюорохромов, используют другие самые разнообразные специфические маркеры, позволяющие качественно и количественно оценивать содержание в клетке исследуемых соединений. Модификацией рассматриваемого метода является введение меченых антител в цитоплазму живых клеток с помощью микроманипуляторов.

Метод культуры клеток , тканей заключается в выращивании клеток и тканей вне организма в искусственных питательных средах (в условиях in vitro). Для получения изолированных клеток производят предварительную обработку материала ферментами трипсином или коллагеназой. Метод позволяет изучать реакции клеток на различные воздействия, механизмы регуляции пролиферации, дифференцировки и гибели. Особенно важное значение данный метод имеет для эмбриологических и цитофизиологических исследований, а также для трансплантации эмбриональных клеток при лечении врожденных и приобретенных дефектов обмена веществ.

Микроскопическая хирургия клетки - совокупность методических приемов, осуществляемых с помощью специального прибора - микроманипулятора. Этот прибор позволяет производить различного рода тончайшие операции на клетке (введение веществ, удаление или пересадка структурных компонентов клетки, нанесение уколов, разрезов и пр.) и нашел широкое применение в эмбриологии.

Цейтрафферная, или замедленная , микрокино- или видеосъемка - изучение живых клеток. Такой способ позволяет проследить за медленно протекающими изменениями клеток.

Метод фракционирования (дифференциального центрифугирования) клеток. Его суть заключается в получении из клеток изолированных структурных компонентов. Основан на разных скоростях осаждения этих компонентов при вращении гомогенатов клеток в ультрацентрифугах. Данный метод сыграл и играет очень важную роль в изучении химического состава и функциональных свойств субклеточных элементов - прежде всего, органелл.

Конфокальная микроскопия - современный метод, использующий в качестве осветителя лазерный луч, который последовательно сканирует всю толщину препарата. Информация о плотности объекта по каждой линии сканирования передается в компьютер, где специальная программа осуществляет трехмерную реконструкцию исследуемого объекта.